Новая эра хроматографии - системы Acquity UPLC фирмы Waters

В течение последних 30 лет ВЭЖХ подтвердила себя как главная технология, используемая в лабораториях по всему миру. Одной из главных сил, движущих развитием этой технологии, являлась эволюция хроматографических сорбентов. В основе развития технологии сорбентов лежат принципы, объясняемые уравнением Ван Деемтера, с которым знаком каждый студент, изучающий хроматографию. Уравнение Ван Деемтера - это эмпирическая формула, которая описывает зависимость между линейной скоростью (скоростью потока) и высотой теоретической тарелки (или эффективностью колонки). Так как размер частицы является одной из переменных, то кривые Ван Деемтера могут быть использованы для исследования работы хроматографа. ( Рис.1)

Рис.1

В соответствии с уравнением Ван Деемтера с уменьшением размера частицы в область менее 2.5 мкм, значительно увеличивается эффективность, кроме того она не ухудшается с увеличением скорости потока или линейной скорости. Используя меньшие частицы, скорость анализа и пиковая емкость (количество пиков разделенных за единицу времени) могут быть продвинуты к новым пределам, обозначаемым термином UPLC. Используя UPLC, теперь возможно воспользоваться всей полнотой хроматографических принципов, для того чтобы выполнять разделения с использованием более коротких колонок и/или более высоких скоростей потока наряду с превосходным разрешением и чувствительностью.

Химия маленьких частиц

Меньшие частицы обеспечивают не только увеличение эффективности, но и возможность работы при увеличенной линейной скорости без потери эффективности, увеличивая одновременно и скорость и разрешение. Эффективность - это главный параметр разделения и для UPLC, поскольку он зависит от тех же величин селективности и удерживания, что и для ВЭЖХ. В фундаментальном уравнении:

Rs = Ц N ( a -1)*( k ),

где первый сомножитель определяет эффективность, второй - селективность, а третий - удерживаемость, разрешение пропорционально квадратному корню из N, так как N обратно пропорционально размеру частиц,

N » 1/dp, т.е с уменьшением размера частицы в три раза ( с 5 до 1.7 мкм ), N возрастает в 3 раза, а разрешение в Ц3 , т.е. в 1.7 раза.

В то же время N обратно пропорционально квадрату ширины пика: N » 1/w 2

Это означает, что чем уже пики, тем легче их разделение. К тому же высота пика обратно пропорциональна его ширине. То есть с уменьшением зернения частиц увеличивается эффективность и, следовательно, разрешение Rs, а также чувствительность, так более узкие пики становятся более высокими. Более узкие пики также означают бoльшую пиковую емкость в градиентных режимах.

Ещё одна зависимость играет роль при переходе к мелкозернистым сорбентам.

Fopt » 1/dp, которая также является следствием уравнения Ван Деемтера и означает, что при уменьшении размера частиц оптимум потока растворителя, необходимого для достижения максимальной эффективности, также увеличивается. Так как давление в колонке, создаваемое потоком растворителя, прямо пропорционально скорости потока, работа с мелкозернистыми сорбентами приводит к более высокому рабочему давлению, т.е требуется система, которая будет создавать плавный поток при заданном давлении. Более высокое разрешение и эффективность могут оказать и большую помощь, однако когда скорость анализа является приоритетом.

Эффективность прямо пропорциональна длине колонки и обратно пропорциональна размеру частиц. Поэтому длина колонки может быть соответственно уменьшена при уменьшении зернения без потери в разрешении. Увеличив скорость потока в 3 раза и уменьшая длину колонки на треть, можно получить выигрыш по времени анализа в 9 раз при сохранении разрешения на прежнем уровне!

Однако разработка и производство частиц с размером менее 2 мкм является трудной задачей, и исследователи были очень активны в этой области, чтобы добиться коммерческого успеха. Хотя высокоэффективные непористые 1,5 мкм частицы коммерчески доступны, они страдают недостатком - низкой поверхностной площадью, которая приводит к плохой емкости и разрешению. Для поддержания параметров удержания и емкости на уровне ВЭЖХ, UPLC должна использовать современные пористые частицы, которые могут выдерживать высокие давления. Силикагелевые частицы имеют хорошую механическую прочность, а также большое число недостатков, которыми являются хвостизм основных анализов и ограниченный диапазон pH . Другая альтернатива - полимерные колонки - могут преодолеть ограничение рН, но имеют свои собственные недостатки, включая низкую эффективность и ограниченную емкость. В 2000 году «Waters» выпустила первое поколение гибридных частиц, называемых ХTerra, которые объединяют лучшие свойства, как силикагелевых, так и полимерных колонок - они механически прочны, имеют высокую эффективность и работают в большом диапазоне рН.

Колонки ХTerra производятся с использованием классического твердогелевого синтеза, который инкорпорирует углерод в форме метильных групп.

Однако, для обеспечения той механической стабильности, которая требуется для UPLC, было разработано второе поколение гибридных частиц [4], называемых Acquity BEH (Bridged Ethyl Hybrid). Частицы размером 1,7 мкм имеют метильные мостики в каркасе, которые улучшают их механическую стабильность (Рис.2).

Упаковка таких частиц в воспроизводимые и устойчивые колонки также явилась трудной задачей, которую нужно было преодолеть. Внутренняя поверхность колонки должна быть более гладкой и концевые уплотнители были заново сконструированы для удержания мелких частиц и для противостояния к забиванию. Равномерность набивки также критична, особенно для коротких колонок, чтобы поддерживать разрешение одновременно с ускорением разделения. Все колонки ACQUITY UPLC снабжены микрочипом eCord, в котором записана вся выходная производственная информация о каждой колонке, включая тесты контроля качества и сертификат анализа. При работе с системой Waters ACQUITY UPLC, база данных eCord может быть дополнена информацией о реальном использовании, такой как: количество инжекций, давление, температура и другое для поддержания полной истории колонки.

Извлечение выгоды из маленьких частиц

Чтобы по-настоящему воспользоваться преимуществами возросшей скорости, превосходных разрешения и чувствительности, обеспечиваемых маленькими частицами, технология приборов должна идти следом за частицами. Стандартные системы ВЭЖХ просто не в состоянии обеспечить все преимущества, обеспечиваемые зернением менее 2 мкм. Потребовалась совершенно новая конструкция системы, с продвинутыми технологиями в насосе, автоинжекторе, детекторе, системе обработки данных и сервисных диагностиках. Система ACQUITY UPLC была разработана с нуля для обеспечения минимального системного объема, чтобы полностью воспользоваться преимуществом низкой дисперсии и технологией маленьких частиц.

Разделения с высокой пиковой емкостью, достижимые с маленькими частицами требуют более высоких давлений, чем те, которые достижимы с сегодняшним ВЭЖХ оборудованием. Рассчитанное давление при оптимальном потоке, для достижения максимальной эффективности на 15 сантиметровой колонке, упакованной 1,7 мкм частицами около 15 тыс. фунтов на квадратный дюйм (PSI). Таким образом, требуется насос, способный подавать раствор точно и воспроизводимо при таких давлениях, а также компенсировать сжимаемость раствора и работать как в градиентном, так и изократическом режимах разделений.

С частицами 1,7 мкм были получены пики с шириной на половине высоты менее чем за 1 секунду. Таким образом, предъявляются соответствующие требования к детектору. Для того чтобы точно и воспроизводимо продетектировать пик, скорость измерения должна быть достаточно высока, чтобы набрать достаточное количество точек по ширине пика, в добавление ячейка детектора должна иметь минимальный объем, чтобы сохранить эффективность разделения. Теоретически, увеличение чувствительности по сравнению с ВЭЖХ должно быть на уровне в 2 - 3 раза, в зависимости от применяемого типа детекции. Масс-спектрометрическая детекция значительно улучшается с UPLC - увеличенная концентрация внутри пика с уменьшенной хроматографической дисперсией на уменьшенных потоках (без делителей потока) обеспечивает лучшую эффективность ионизации и увеличивает чувствительность.

Ввод образца также критичен. Традиционные инжекционные клапаны, автоматические или ручные, разработаны не для высоких давлений. Для защиты колонки от экстремальных флуктуаций давлений процесс инжекции должен быть относительно безимпульсационным.